一份超详细的DNA甲基化技术指南·下篇
在上篇中,我们整理了几种研究DNA甲基化的技术(一份超详细的DNA甲基化技术指南·上篇),本期小编主要详细介绍一下诺禾致源提供的WGBS、850K甲基化芯片及RRBS技术服务。
基于全基因组重亚硫酸盐转化的WGBS法,能够实现单碱基分辨率的甲基化位点精准、高效定位。通过全面分析不同处理方式下的全基因组甲基化水平,快速准确鉴定出差异甲基化区域,有助于我们更加全面深入地了解动、植物的甲基化模式和表观调控机制,在动物行为、植物胁迫、植物性状、胚胎发育、癌症疾病、生物标记物等方面具有广泛的应用。
1.1 建库原理
WGBS技术目前存在两种建库技术手段:Pre-BS和Post-BS。传统WGBS建库流程是先加接头再进行Bisulfite处理,建库过程将导致大量DNA模板流失(~90%),造成了极大的损失。采用先进行Bisulfite转化再构建文库的策略(Post-Bisulfite Construction),能够有效规避文库模板损伤,同时,显著降低了DNA起始量,并提高文库丰富度,获得更多的有效数据。诺禾采用先BS转化再构建文库(Post-Bisulfite Construction)的方式,亦称为微量建库,相对于市面上传统建库(起始量3μg DNA,先加接头再BS转化)的适用性更强。
诺禾致源目前采用的Post-Bisulfite Construction建库流程如图(左)所示。
微量建库除可获得丰富、全面的单碱基分辨率的全基因组范围所有DNA甲基化情况外,在传统与微量建库的测试中发现,后者的平均覆盖深度相对较高。同时,在物种人的测试中,微量建库的甲基化C位点检出数量接近传统建库的2倍。
微量建库需要多少的样本量呢?
目前诺禾致源的微量建库可低至100ng(更低起始量可咨询后台),对于一些珍贵的医学样本显得尤为合适。与此同时,诺禾致源的微量建库已推出38天极致周期!
1.2 项目经验
诺禾致源拥有丰富的微量建库项目经验,话不多说,咱们数据为证:
除动植物样本外,平菇、香菇、稻瘟病菌、 大丽轮枝菌、藻类等物种也均有项目经验!
1.3 基本(标准)分析
微量建库的测序数据可以做哪些分析呢?我们通过一张图片了解一下可以进行的分析内容吧!
1.4 基本(标准)分析部分内容展示
1.4.1 甲基化密度、水平的分布
染色体甲基化密度circos图
1.4.2 基因组功能区域、genebody上下游的甲基化水平
样本甲基化水平在不同基因组元件上的分布
1.4.3 差异甲基化区域(DMR)分析结果
(1) chr :染色体ID
(2) start :DMR起始位点
(3) end :DMR终止位点
(4) diff.Methy :差异甲基化水平
(5) areaStat :统计显著值,其绝对值越高表明区域差异越明显
(6) C_context :序列环境类型
(7) region : 区域类型
(8) Gene name : 若为基因ID相关区域,并且有基因名称和相关描述
(9) Gene description : 基因相关描述
1.4.4 比较组样本的甲基化水平及整体差异
不同比较组甲基化水平比较制作circos图
1.4.5 比较组合基因上下游的甲基化水平
比较组合在基因上下游2K甲基化水平的分布
基于DMR在基因组上的分布,对DMR相关基因、DMR锚定promoter基因进行功能富集分析,以更深层次挖掘出所研究的生物学问题相关的生物学过程。
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1.5 关联分析
二代测序的高速发展为多组学、多平台的联合应用奠定了基础,成为研究表观调控的重要手段。同样,多组学的联合分析也成为了很多研究的亮点,也是研究的趋势。甲基化与转录组的联合,相当于多层次,多维度的解释某个生物学事件,多角度论证生物学问题。
通过DNA甲基化与基因表达进行关联分析,可以帮助我们了解DNA甲基化修饰与RNA表达是否存在相关性,样本中的哪些基因的表达受到DNA甲基化修饰的影响以及对应的基因的功能。因此WGBS和转录组的联合分析广泛应用于疾病研究,生物性状等多种领域。如从DNA甲基化和转录水平揭示了基因组多倍化如何增强水稻在盐胁迫环境中的适应能力[1];抗病、抗逆过程中的动态表观修饰变化[2]等。
与IPF相关的差异甲基化区域(DMR) 的基因表达变化[3]
根据多组学文章中的应用场景和经验,诺禾也搭建了内容丰富的WGBS与mRNA关联分析流程,以助力科研者们发表更多高分文章。关联分析会进行整体层面关联分析,同时也会进行差异表达与差异甲基化区域(DMR)相关基因的关联分析。
甲基化与转录组关联分析流程
1.6 关联分析内容展示
1.6.1 转录组reads密度与甲基化密度的分布
染色体reads密度与甲基化密度Circos图
1.6.2 甲基化水平及与差异基因表达水平关系
DMR差异甲基化水平与差异基因表达水平关系
1.6.3 转录组差异基因与DMR相关基因
韦恩图
1.6.4 交叠基因在genebody及上下游的甲基化水平
交叠基因genebody及其上下游2kb甲基化水平分布
DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点,它与基因表达和表型性状息息相关。很多科研者也致力于特定区域甲基化的研究,因此简化甲基化测序也多被用于基因组DNA甲基化研究。简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)作为一种 DNA 甲基化研究方法,可在基因组水平上实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率,在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
2.1 技术简介
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)通过酶切富集启动子及 CpG 岛区域,并进行 Bisulfite 测序。
2.2 RRBS建库及分析流程
获得原始测序序列后,通过如下流程进行生物信息分析:
RRBS分析流程图
2.3 技术优势
1.精确度高
在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。
2. 重复性好
适用于多样本间的差异分析,多样本间覆盖重复性高于85%。
3. 检测范围广
RRBS检测范围可覆盖全基因组内8-12百万CpG位点 。
4. 性价比高
局部区域甲基化研究时,RRBS所需检测数据量更少,数据利用率更高。
DNA甲基化在调节基因表达中扮演着重要的角色。研究表明,异常甲基化(高甲基化或低甲基化)与基因表达的抑制和一些疾病的发病机制存在联系。近几年,甲基化芯片凭借自身稳定性,可重复性好的优势,在DNA甲基化研究领域大放异彩。
Illumina自2009年推出首款DNA甲基化芯片——Human Methylation27 BeadChip后又陆续推出其升级版450K及850K甲基化芯片。在这里小编主要介绍一下450K的升级版芯片-850K甲基化芯片。
3.1 技术简介
850K甲基化芯片采用了两种探针Infinium Ⅰ和Infinium Ⅱ对甲基化进行测定,且针对FFPE样本设计有专门的FFPE样本修复试剂盒,能够大大提高 FFPE 样本的甲基化位点检出率和数据准确性。
3.2 检测原理
850K甲基化芯片的探针原理
芯片检测原理:
探针一:对于每个甲基化位点,都对应设计有两种探针:M 型磁珠、U 型磁珠。M 型磁珠尾部为 G,用来检测甲基化位点。U 型磁珠尾部为 A,用来检测未甲基化位点。
基因组上的某一位点,如果被甲基化了,那么在亚硫酸氢盐的处理下,GC 仍为 GC,与 M 型磁珠配对,荧光标记的核苷酸掺入后能被检测到荧光信号。M 型磁珠发光。反之,如果没有被甲基化,那么在亚硫酸氢盐的处理下,GC 变为 GT,与 U 型磁珠配对,延伸后 U 型磁珠发光。
往期文章中我们也为各位老师详细整理了甲基化芯片的检测原理、技术优势(DNA甲基化,从“芯”出发)及Infinium HD FFPE 修复试剂盒的修复原理(FFPE样本甲基化检测,不再难~~)
Infinium HD FFPE 修复试剂盒修复原理
3.3 芯片数据分析
850K甲基化芯片数据中,首先需要对原始数据进行质控和探针过滤以确保后续分析数据有效准确。利用 BMIQ 方法对 beta 值矩阵归一化;通过组信息和筛选标准筛选差异甲基化位点和差异甲基化区域;根据差异甲基化位点和差异甲基化区域的注释信息,对相关基因进行功能富集分析;最后进行表观功能模块分析和拷贝数变异分析。
甲基化芯片数据分析流程图
3.4 关联分析
为了满足老师们对数据分析越来越高的要求,芯片数据与转录组数据的联合分析模块当然也是不可少的啦!
3.5 关联分析内容展示
甲基化与转录组联合分析小提琴图
甲基化与转录组联合分析散点图
针对不同研究目的选择性价比更高的甲基化研究方法固然重要,当然,验证方法也是必不可少的。随着甲基化研究的不断深入,多个甲基化检测验证方法也令科研者们举棋不定。以下验证技术提供给科研者们作为参考:
作为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容的DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。正如发表在《Lancet》上的“Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine”[4]文中描述的那样:DNA甲基化是一个标记遗传文本的注释系统,可提供如何及何时读取信息并控制转录的指令。虽然现在已经对DNA甲基化在人类生物学中的作用有了全面了解,但仍有许多与医学密切相关的热点研究领域值得去探索。愿各位老师在科研的道路上以梦为马,一往无前~
如何从三种甲基化研究方式选择最适合自己的呢?
1、如果暂时还没有特定要研究的基因或者位点,只是想要看看不同样本中的基因组DNA的甲基化情况,那么WGBS、RRBS可以作为您的选择:
WGBS-可获得全基因组范围内单碱基分辨率的所有DNA甲基化情况,信息最为丰富、全面。
RRBS-可获得CpG岛富集区域单碱基分辨率的DNA甲基化情况,成本低,但物种有限制。
2、已有明确的研究内容
如想要基于全基因组水平进行DNA甲基化研究,可选择WGBS;多应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究。
如仅进行CpG岛富集区域(限人、小鼠等高等哺乳动物)则可选择RRBS;多应用于动物物种的甲基化研究。
如已经确定了要检测的甲基化位点(比如通过文章或者其他相关疾病的研究),想看一下自己研究疾病的同位点甲基化情况,那么850K甲基化芯片可作为优选哦~
参考文献:
[1] Wang L , Cao S , Wang P , et al. DNA hypomethylation in tetraploid rice potentiates stress-responsive gene expression for salt tolerance[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2021, 118(13).
[2] Xu J, Zhou S, Gong X, et al. Single-Base Methylome Analysis Reveals Dynamic Epigenomic Differences Associated with Water Deficit in Apple. Plant Biotechnol J, 2017.
[3] Ivana, V, Yang, et al. Relationship of DNA methylation and gene expression in idiopathic pulmonary fibrosis.[J]. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine, 2014.
[4] Dor, Yuval, Cedar, et al. Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine[J]. The Lancet, 2018.
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